細(xì)胞內(nèi)ELISA實(shí)驗(yàn)方案

細(xì)胞內(nèi)ELISA（也稱為基于細(xì)胞的ELISA、細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡或細(xì)胞印跡）是一種使用比色或熒光讀數(shù)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行定量的廣為接受的免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定方法，用于量化培養(yǎng)細(xì)胞中的靶蛋白或靶蛋白的翻譯后修飾。

     這里我們提供了96孔微孔板的通用方案。大致流程包括：培養(yǎng)細(xì)胞（根據(jù)需要進(jìn)行處理）并將其接種到包被的96孔微孔板中；固定和透化后，將一抗添加到孔中并孵育，然后添加標(biāo)記的二抗，最后進(jìn)行檢測(cè)和分析。

一、準(zhǔn)備細(xì)胞

     粘附細(xì)胞可以在推薦的分析微孔板中生長(zhǎng)，或直接接種到分析微孔板中并允許其附著貼壁幾個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。

所需材料

     - 96孔微孔板：底部透明

（續(xù)寫內(nèi)容）

二、固定與透化處理

固定步驟需在細(xì)胞貼壁完成后進(jìn)行。建議使用4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，隨后用PBS輕柔洗滌3次。透化處理可選用0.1% Triton X-100或0.5% Tween-20溶液，作用5分鐘以增加細(xì)胞膜通透性，便于抗體滲透。注意透化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致蛋白流失，需根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位優(yōu)化條件。

三、抗體孵育與信號(hào)放大

1.封閉：每孔加入200 μL含5% BSA的PBS，室溫封閉1小時(shí)，減少非特異性結(jié)合。

2. 一抗孵育：稀釋一抗于封閉液中（建議參考抗體說(shuō)明書優(yōu)化濃度），每孔加入100 μL，4℃過(guò)夜或室溫孵育2小時(shí)。若檢測(cè)磷酸化蛋白，需在裂解緩沖液中添加磷酸酶抑制劑。

3. 二抗標(biāo)記：洗滌后加入HRP或熒光標(biāo)記的二抗（避光操作），室溫孵育1小時(shí)。為增強(qiáng)信號(hào)，可選用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)。

四、檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

1. 比色法：加入TMB底物顯色10分鐘，2M H?SO?終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)讀取吸光度。

2. 熒光法：若使用熒光二抗，直接通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)（如FITC: 488/520 nm）。

3. 標(biāo)準(zhǔn)化：建議同時(shí)設(shè)置β-actin或GAPDH內(nèi)參孔，數(shù)據(jù)以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參比值呈現(xiàn)。

注意事項(xiàng)

- 細(xì)胞密度需控制在70%-90%匯合，過(guò)高易導(dǎo)致信號(hào)飽和。

- 每步洗滌需徹底（3×5分鐘），避免殘留試劑干擾。

- 對(duì)于弱表達(dá)蛋白，可延長(zhǎng)一抗孵育時(shí)間或提高二抗靈敏度。