小鼠腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒檢測原理

小鼠腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒檢測原理

     將目標(biāo)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的目標(biāo)連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，將未結(jié)合的抗體洗凈后再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。首先，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的加樣體積需精確至微升級別，避免因加樣誤差導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線偏移。洗滌步驟尤為關(guān)鍵，需采用洗板機(jī)或手動充分洗滌，每次洗滌后需在吸水紙上拍干孔內(nèi)液體，避免交叉污染。

    顯色反應(yīng)對時(shí)間和溫度敏感，建議在25℃避光環(huán)境下孵育15-30分鐘，待標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯梯度藍(lán)色后，及時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。終止后30分鐘內(nèi)應(yīng)完成讀數(shù)，避免顏色衰減影響OD值。

    數(shù)據(jù)分析時(shí)，建議采用四參數(shù)邏輯曲線擬合（4PL）法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其能更好地反映低濃度與高濃度區(qū)間的非線性關(guān)系。若樣本OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，需用稀釋液適當(dāng)稀釋后重新檢測。此外，復(fù)孔檢測的CV值應(yīng)控制在15%以內(nèi)，以確保數(shù)據(jù)可靠性。

    該試劑盒適用于血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本類型，但需注意避免反復(fù)凍融或溶血樣本，以免干擾檢測。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程和嚴(yán)格質(zhì)控，可高效評估炎癥、感染或腫瘤微環(huán)境中的TNF-α水平，為基礎(chǔ)研究與臨床診斷提供精準(zhǔn)數(shù)據(jù)支持。