人膀胱癌順鉑耐藥株BIU-87/DDP操作流程

人膀胱癌順鉑耐藥株BIU-87/DDP操作流程：

1、取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)，然后換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。

2、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3）棄上清，沉淀細胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，*后放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細胞完全貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。

4、細胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min；

3）棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。